<Gene rearrangement>
lmmuoglobulin과 TCR의 다양성을 결정하는 데 가장 중요한 기작으로 이는 크게 3군데에 일어납니다.
1> 항체의 Heavy chain과 Light chain의 Variable regions
2> TCR의 Va, VB region
3> CDR (항체와 TCR의 antigen binding site를 결정한다.)
인간 genome에는 30억 개의 nucleotide가 존재하고 5만개의 유전자를 coding할 수 있지만, 이 것만으로는 antigen receptor의 충분한 diversity를 형성할 수 없는데요!!
이를 해결하기 위해 Variable region은 초기에 gene segment 형태로 존재하고, lymphocyte가 성장하면서 somatic DNA recombination에 의해 재배열되는 방식을 취해 다앙성을 형성합니다.
사람에서 Antibody/lmmunoglobulin repertoire는 10^11 이상이라고 알려져 있지만,
‘사람들마다 B cell의 숫자가 다르고’, ‘과거에 항체와 만났던 경험이 다르기 때문에’ 차이가 존재합니다.
이러한 diversity를 설명하는 이론에는 2가지가 존재하는데요!
1> Germline theory(diversity를 만족시키기 위해)
2> Somatic diversification theories
→ Germline theory로는 충분한 다양성을 확보하기 어렵고, 나중에 변형이 일어납니다.
Variable region의 DNA는 ‘gene segment로 존재하고’, ‘전체는 아니지만 일정 부분에서 rearrangement가 일어나서 더 다양한 항체를 형성’하기 때문에 두 이론 모두 옳다고 할 수 있습니다.
추가적으로 somatic hypermutation도 일어나 diversity를 증가시킵니다.
Rearrangement가 일어나기 전에는 V gene segment와 J gene segment로 구성됩니다.
‘CDR1, CDR2는 V gene segment’로부터, ‘CDR3 joining sequence’로부터 형성됩니다.
CDR3는 V, D, J segment의 joining을 통해 diversity가 훨씬 증가하게 되며 D는 heavy chain에 존재합니다!
<Somatic rearrangement의 과정>
1) Heavy chain의 경우 D-J rearrangement가 먼저 일어나 접합됩니다.
2) Heavy chain은 V-DJ rearrangement, Light chain은 V-J rearrangement가 일어나 접합합니다.
3) 생성된 V-region gene의 Splicing을 통해 C(constant region)과 joining하여 mRNA를 형성합니다.
4) Translation되고 light chain과 heavy chain이 조립되어 polypeptide chain이 형성됩니다.
이로 인해 light chain, heavy chain의 assembly를 통해서 combinatorial diversity가 더욱 증가합니다.
Heavy chain의 다양한 C region은 light chain과는 다르게 isotype 결정에 중요한 역할을 합니다.
다른 isotype의 heavy chain은 다른 effector 기능을 수행합니다.
<V, D, J gene segment의 rearrangement 과정>
이 과정에서 RSS(Recombination Signal Sequence)가 매우 중요합니다.
1. Heptamer+23-base pair spacer+Nonamer
2. Nonamer+12-base pair spacer+heptamer
이들은 gene segment에 바로 붙어서 존재하는데 Chain마다 그 방법이 다릅니다!
1) λ chain : V segment + 23 RSS // 12 RSS + J segment
2) κ chain : V segment + 12 RSS // 23 RSS + J segment
3) Heavy chain : V segment + 23 RSS // 12 RSS + D segment + 12 RSS // 23 RSS + J segment
12/23 rule : Recombination이 일어날 때 12 RSS와 23 RSS끼리만 pairing할 수 있는 규칙
따라서 원칙적으로는 Heavy chain에서 D segment를 건너뛸 수 없습니다.
이러한 rule은 recombinase의 작용과 관련이 있습니다!
Rearragement를 매개하는 인자 중 가장 중요한 것은 RAG-1, RAG-2, recombinase입니다.
이는 lymphocyte specific한 인자로 특정 시기에만 발현하며 Rearrangement의 첫번째 과정을 매개합니다.
Rearrangement는 gene segment의 transcription 방향에 따라 다르게 일어나는데요!
[Transcription 방향이 같을 때(forward-oriented)]
1> Loop 형성
2> 윗부분(Circular piece)은 떨어져 나가고 이는 signal joint를 포함
3> 아래는 coding joint 형성
[Transcription 방향이 다를 때]
1> Coil이 형성
2> inversion 발생
3> Extra circle(=Circular piece), signal joint는 떨어져 나가지 않음, 즉 sequence는 계속 가져간다는 의미
5%의 항체에서는 12/23 rule에 벗어나는 D-D joining이 발생하여 매우 긴 CDR3 loop를 형성합니다.
Transcription 방향이 같은 경우, 중간에 있는 DNA는 떨어져 나가고 rearrangement가 더 자주 일어납니다.
하지만 κ light chain의 경우, Vκ gene segment의 절반이 Jκ gene segment와 방향이 다릅니다.
따라서 50%는 두번째 반응이 나타납니다.
<RAG-1, RAG-2와 같은 효소의 반응>
RAG-1, RAG-2는 lymphocyte specific합니다. 그리고 Gene Arrangement에서 가장 중요합니다!
1> RAG-1:2 complex를 형성하고 이는 RSS 2개를 인지해 binding합니다.
2> RAG는 nuclease activity가 있어서 endonuclease activity를 통해 서열이 잘립니다.
3> Repair가 일어나는데 이때 관여하는 인자들은 lymphocyte specific하지 않습니다.(=Ubiquitous)
4> 대표적으로 Ku70:Ku80 complex가 있는데 Ring like structure를 형성해서 DNA에 binding합니다.
5> Coding joint와 Signal joint 모두에 형성됩니다.
6> 이 부위에 DNA-PK:Artemis complex가 합쳐집니다.
7> 이는 endonuclease activity가 있어서 random하게 DNA hairpin을 자릅니다.
8> 끊어진 DNA에 TdT가 작용하여 random하게 nucleotide를 더하기도 제거하기도 합니다.
9> 이 과정에서 diversity가 증가됩니다. 하지만 Nonfunctional한 결과를 초래할 수도 있습니다.
10> DNA ligase iV:XRCC4 complex가 최종적으로 repair를 마무리합니다.
<Ubiquitous Proteins>
RAG를 제외한 protein들은 Ubiquitous protein입니다. (repair 기전에 기여합니다.)
NHEJ,DSBR에 관여하는 enzyme들이 이에 해당합니다.
앞서 나왔던 Ku70, Ku80, DNA-PK, Artemis, DNA ligase IV, XRCC4 등이 해당됩니다!
앞서 언급하지 않았던 DNA polymerase μ, λ 도 DNA-end fill-in synthesis에 참여합니다.
polymerase μ는 template independent manner로 nucleotide를 붙여주기도 하면서 작용합니다.
DSBR joining process는 부정확한데, 이는 nucleotide add or loss 때문입니다.
이것은 DNA mutation입장에서는 부정적이지만, lymphocyte에서는 diversity를 증가시키는 수단으로 사용됩니다.
<Immunoglobulin repertoire의 diversity를 증가 시키는 주요 요소들>
1) 다양한 gene segment들이 조합되어 다양한 V region을 형성합니다. (Combinatorial diversity)
2) Joint가 형성되는 과정에서 nucleotide가 더해지거나 제거합니다. (junctional diversity)
3) Heavy chain과 light chain이 조합되며 다양성이 증가됩니다.(Combinatorial diversity)
4) Somatic hypermutation: Rearrangement 이후 B cell의 성숙에서 발생합니다.
Combinatorial diversity 만으로는 1.9 x 10^6개의 서로 다른 항체가 생성될 수 있습니다.
여기에 Junctional diversity를 추가하여 결국 10^11개 이상의 서로 다른 항체들이 생성될 수 있으며 따라서 Naive B cell에서 다양한 항체 repertoire가 형성될 수 있습니다.
<Junctional diversity>
CDR3는 diversity가 가장 크고 항원 binding에 가장 중요한 부분입니다.
이러한 diversity는 junction에서의 addition과 deletion에 의해 증가됩니다.
(주로 addition이지만 deletion도 할 수 있습니다.)
Junctional diversity가 가장 많이 기여하는 곳은 CDR3입니다.
Nucleotide addition시 두 종류의 nucleotide가 더해질 수 있습니다.
P-nucleotide: Palindromic sequence(같은 것이 반복되는 시퀀스)
N-nucleotide: Non-template encoded(즉, random), TdT enzyme에 의해 추가됩니다.
TdT는 B cell development 과정에서 heavy chain arrangement가 일어날 때 가장 많이 발현됩니다.
N-nucleotide는 light chain보다 heavy chain에서 흔합니다.
이는 light chain이 heavy chain보다 늦게 rearrangement되기 때문입니다!
P, N nucleotide가 더해지는 과정은 random하게 일어납니다.
따라서 frame에 맞지 않는 sequence가 형성될 수도 있습니다.
즉 nonproductive rearrangement가 발생해 nonfunctional protein이 형성될 수 있습니다.
3번 중 2번은 nonproductive rearrangement가 발생합니다.
비효율적이지만 그럼에도 junctional diversity형성은 개체의 생존에 있어서 매우 필수적이기 때문에 많은 대가를 치루면서도 진행합니다.
이 과정은 random하기 때문에 P,N nucleotide가 더해진 sequence는 unique합니다.
따라서 somatic hypermutation이 어떻게 일어났는지 연구하는 clone의 marker가 되기도 합니다.